全内反射荧光(Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF)是一种用于降低背景荧光以增加图像信噪比的技术。当光由高折射率的介质向低折射率介质传播时,会在两种介质的界面处同时发生折射和反射(如图1A),随着入射角度的增加,反射光强度逐渐增加而折射光强度逐渐较小。当入射角度大于临界角时会发生全发射,即折射光强度为0,反射光强度等于入射光强度。发生全反射时,光会在界面处形成厚度约200nm左右的渐逝场,其强度随着距离呈指数衰减,只有进入渐逝场内并且距离界面小于100nm的荧光分子才会被激发。通过这种方式可以大大限制z轴方向上的样品激发,降低溶液本体的干扰。因此,TIRF广泛的应用于表面单分子实验,超分辨成像 (STORM,PALM等)和单分子测序等。

1471940426138570.png

图1 全反射及TIRF显微镜的原理


根据光路结构的不同,TIRF可以分为基于棱镜的和基于物镜的两种(如图2)。


blob.png

图2 常用的两种TIRF结构


基于棱镜的TIRF有如下特点:

(1)激发面积大;

(2)采用低数值孔径的物镜,光的接收效率低;

(3)光学参数易于控制;

(4)样品不易接触。

而基于物镜的TIRF的特点为:

(1)激发面积小;

(2)采用高数值孔径的物镜,光的接收效率高;

(3)光学参数较难控制;

(4)易于接触样品;

(5)激光会经过二向色镜两次。

   其中第五个特点决定了两种类型的TIRF在滤光片的选择上会有差异。在基于物镜的TIRF中,激光是沿原路返回后再次被二向色镜反射,发射片不仅要阻挡入射激光的散射光,还要阻挡反射激光以及高角度的散射光。通常发射片在激光谱线处的OD值做到6就能满足普通激光应用的要求,但是在基于物镜的TIRF中,需要OD值超过8才能完全将激光滤掉。

1.滤光片的选择

Chroma滤光片组有两种方式可以使OD值超过8。对于单色TIRF,可以将一个带通发射片和一个长通发射片组合起来,使整体在激光谱线及附近的OD值超过8。


1471940653946699.png


图3 单色TIRF滤光片组


对于多色TIRF,根据显微镜结构的不同,会有两种不同的滤光片组。如果显微镜配有滤光片转盘,可将一个常规的多波段发射片(OD6的阻挡)装到cube中,在滤光片转盘中装上相应的单波段带通滤光片(最后一个波段可用长通),通过转盘切换不同的带通滤光片,进而收集不同波段的信号,同时又能很好的阻挡激光谱线。

1471940772104928.png


图4 适用于配备滤光片装盘的显微镜的多色TIRF滤光片组


对于没有滤光片转盘的显微镜,可以将两片多波段发射片叠加后装到一个外圈里(厚度较常规滤光片要厚)。

1471940904437805.png


图5 适用于无滤光片转盘的显微镜的多色TIRF滤光片组


2.二向色镜表面平整度对TIRF实验的影响

影响滤光片表面平整度的因素包括反射波前畸变(Reflected wavefront distortion, RWD)和透射波前畸变(Transmitted wavefront distortion, TWD)的大小,楔角的大小(如图6)以及应力造成的曲率半径的大小(如图7)。在基于物镜的TIRF中,激光被二向色镜反射后进入物镜发生全内反射,所以RWD和曲率半径的大小是影响TIRF实验的关键因素。


1471941031522405.png

图6 反射波前畸变,透射波前畸变和楔角


在通常的激光应用中,如共聚焦显微镜,二向色镜的RWD需要控制在2waves/inch及以下。但对于TIRF实验,则需要控制在0.5waves/inch及以下。另外,二向色镜的厚度也必须在2mm及以上。如果厚度太薄(如1mm),在稍微施加应力的情况下就会使二向色镜产生一定的曲率半径,导致激光光束在反射后产生一定的发散,从而使一部分光束发生全发射,而另一部分光束则折射后进入样品,产生较强的背底干扰。


1471941152565007.png

图7 不同平整度的二向色镜对激光光束的影响


图8所示的实验能清楚的表明表面平整度对TIRF实验的重要性。将包含200nm TetraSpeck微球的溶液置于载玻片上,然后采用不同的二向色镜进行TIRF成像。A表示采用常规的1mm厚度二向色镜的成像结果,亮点的出现表明,有部分激光通过折射进入样品将溶液本体中的微球激发从而产生荧光。而对于采用了Chroma TIRF专用二向色镜的另一组实验(图8B),则没有任何的荧光产生。表明激光经过二向色镜反射后仍能保持很好的准直性,发生全发射时,没有激光进入本体溶液。

1471941449601885.png

图8 不同平整度的二向色镜对TIRF的影响


3.滤光块盒子(cube)的选择

如上所述,TIRF实验对二向色镜的RWD和厚度都有一定的要求。常规的滤光块盒子无法安装厚度在2mm及以上的二向色镜。另外,由于材质主要为塑料,抗形变能力也较差。针对TIRF应用,Chroma推出了具有专利保护的TIRF专用滤光块盒(专利号:US8488238B2),具有如下特点:

(1)能够安装最大3mm厚度的二向色镜;

(2)能够安装最大厚度6mm的发射片,可以通过两个发射片叠加的方式提高在激光谱线及附近的OD值;

(3)金属材质,抗形变能力强,对安装的二向色镜不会产生应力。

    如果用户同时购买Chroma TIRF滤光片组和cube,建议由Chroma将滤光片和cube装配好。我们可以采用专业的安装工具,使安装后的二向色镜达到最佳的平整状态。