荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)是指利用荧光染料标记的、已知序列的单链核酸作为探针,通过碱基互补配对原则,与待检样品中待检核酸进行特异性结合,然后通过观察荧光信号,从而对样品中待检核酸进行定性,定量及定位分析。FISH具有快速,信号强,特异性高以及可多重染色等特点,广泛应用于产前诊断,基因组结构分析等领域。

影响FISH结果的因素有很多,包括样品准备和处理,显微镜,光源,荧光探针以及滤光片。FISH通常基于荧光显微镜来观测信号,所用滤光片包括激发片,二向色镜和发射片三种。其工作原理如图1所示:

(1)激发片:选择透过光源的某波段的光,用来激发荧光探针;

(2)二向色镜:反射光源的光至样品,透过产生的荧光并反射激发光的散射光;

(3)发射片:选择透过荧光的某波段的光至检测器或人眼,并完全阻挡掉激发光的杂散光。

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1 三种滤光片的工作原理


下面将从如下几个方面探讨FISH实验中滤光片的选择。

1. 滤光片中心波长的位置。

相比于光源的激发光,荧光信号是很微弱的。所以通常会将发射片的中心波长置于染料的最大发射峰位置附近(如图2,以49308滤光片组为例) 。而对于激发片,其和发射片之间必须保持一定的间隔。将透过率谱图转换成OD值谱图时,激发片和发射片曲线会有一个交点,通过这个交点的OD值大小可以判断这套滤光片组在使用时,是否会有光源的光透过发射片对实验结果进行干扰。

通常,光源为汞灯,金属氯化物灯,LEDs等时,交点的OD值要大于等于5; 而对于激光,则要求在6以上。

除了要保证激发片和发射片的交点具有一定的OD值,激发片具体位置的选择还要综合考虑所用光源的谱线位置以及染料的最大吸收位置,因为很多光源的输出为分立不连续的谱线(例如汞灯及金属氯化物灯)。

另外,通过OD值谱图可以发现,二向色镜的OD值要远小于激发片和发射片,表明其阻挡能力很弱。所以二向色镜在使用时只能用于分光和改变光的传播方向,而不能用于完全阻挡光源的杂散光。


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2 49308滤光片组的透过率及OD值谱图


2.滤光片带宽。

FISH实验中,滤光片带宽的大小会对FISH图像的对比度和信噪比产生重要的影响。带宽增加会提高激发和接收效率,使接收的信号增强。但实际接收的信号中包含了有用的荧光信号和降低对比度的背底噪音。带宽的增加会同时增加这两者的强度。如果带宽减小,虽然可以降低背底噪音的强度,但荧光信号也会随之降低。所以对于对比度要求很高的FISH实验,针对于每种具体的染料,都会存在一个最佳的带宽,使FISH图像能够达到最佳的对比度。ChromaFISH滤光片的带宽都是根据常用的FISH染料做过优化,可以为用户的FISH实验提供最佳的对比度的图像。

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3  滤光片的不同带宽对实验对比度的影响。


3.DAPI的影响

DAPI是一种能够与DNA双链特异性结合的有机荧光染料。在FISH实验中,其主要用来对整个染色体进行成像,这也导致了成像时DAPI的浓度要远高于基于单链核酸的荧光探针的浓度。而在有些FISH实验流程中,DAPI是在最后一步进行染色,染色之后也没有清洗的步骤。其浓度会更高。


DAPI的分子结构:

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在使用多带通滤光片进行多色FISH实验中,为了不让DAPI的信号将其他FISH染料的信号掩盖掉,在Chroma的多带通滤光片组中,采用降低激发片在DAPI处的透过率,进而降低激发效率的方式,保证DAPI的信号不至于过高。


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4  三通道FISH滤光片组(69013)


4. DAPIAqua同时成像

因为DAPIAqua的发射峰高度重叠,通常情况下做两者的同时成像会很困难,大量的DAPI信号会将Aqua信号掩盖掉。Chroma69014滤光片组,通过降低DAPI的激发效率,能够实现DAPI,Aqua,GreenOrange四色的同时观察.


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图5  69014滤光片组可以实现DAPIAqua的同时观测


    以上只是关于FISH的几个重点介绍,如有其它任何疑问,可写信至china@chroma.com